皓元新闻

小核酸药物主要包括反义核酸（ASO）、小干扰核酸（siRNA）、微小RNA（miRNA）、小激活RNA（saRNA）和核酸适配体（Aptamer）。近年来，核酸疗法取得了多项突破性成果，目前全球已获批上市的小核酸药物共有16款，包括：5款siRNA药物、9款ASO和2款核酸适配体，约80%的产品是2016年以后上市。小核酸药物研究已成为全球投资新风口和生物制药巨头的必争之地，核酸疗法进入快车道，核酸药物有望成为继小分子化药和抗体药后的第三大类型药物。

小核酸具有较强电负性，分子结构不稳定且容易降解，因此为达到提高稳定性、增加结合亲和力等效果，小核酸药物一般需要经过化学修饰。

▲ 寡核苷酸的修饰类型^[1]

小核酸的合成、化学修饰和分离纯化是一个复杂的多步骤过程。在这些步骤中，分析技术如同药物开发过程的眼睛，掌握小核酸的准确分子量、含量、纯度以及杂质等信息对各步骤的工艺优化有着指导性的意义。同时这些工艺过程也引入新的杂质，给小核酸药物的纯度和杂质分析增加了难度。特别是以液相、质谱为中心的分析方法，仍存在着重复性差和灵敏度低等诸多技术问题。

皓元医药分析服务平台培养、引进了大批专业人才，配备了大量小核酸分析专用的高端精密仪器，测序软件等，积累了丰富的小核酸药物方面的分析经验。

皓元医药基于高效液相的纯度分析方法

1. 基于高效液相的纯度分析方法开发思路

IP-RPLC法方法开发：

色谱柱、柱温、流速、流动相组成以及洗脱梯度进行全面考察，确立最佳分析条件，鉴定分离小核酸中的主要杂质。包括变性和非变性反相方法。通过优化离子对试剂种类与浓度、酸性调节剂的比例以及流动相的种类来改善保留、峰型、响应强度、分离度以及质谱电荷价态分布。

AEX法方法开发的思路：

AEX阴离子交换法是利用离子和固定相之间的相互作用的原理，当pH值在6.5到8之间时，小核酸结构中的每个磷酸二酯键都带有一个负电荷。在恒定的pH下，盐的线性梯度将以增加电荷（因此增加长度）的顺序来洗脱小核酸。

SEC法方法开发的思路：

排阻色谱法根据分子的大小（分子量和分子尺寸）来进行分离分子，可用于分离单链和双链以及分离片段和多聚体的一些杂质。

2. 基于高效液相的纯度分析方法开发案例：

流动相对主峰保留的影响：

柱温对主峰保留和峰型的影响：

柱温对纯度准确性和峰型的影响：

皓元医药基于质谱的小核酸的分子量及序列分析

小核酸属于酸性强极性化合物，每个磷酸二酯键上的酸性质子在ESI软电离过程中均可能发生去质子反应，在 ESI(-) 检测条件下形成多重电荷形式的离子。

MS分析关键及注意事项：

— 减少加合离子Na，K，Fe等金属阳离子，提高质谱灵敏度；

— 改善待测物的多电荷分布，针对丰度较高的前体离子优化质谱参数；

— 溶液pH值，离子对试剂种类和浓度和有机溶剂组成，影响质谱电荷分布和小核酸离子化效率响应强度；

— 减少特异性吸附，在聚丙烯管和玻璃容器中均存在，提高准确性和重现性。

MS分析小核酸序列解析思路和流程：

▲ 寡核苷酸片段的命名方法^[2]

1. 小核酸的分子量解析案例分享

▲ 图1  MS Chromatogram result

▲ 图2  Intact Deconvolution result

2. 寡聚核苷序列解析案例

Inclisiran-AS链序列解析结果：

▲ 图3  Inclisiran-AS MSMS序列分析

▲ 图4  Inclisiran-AS Fragment Coverage Map

Inclisiran-SS链序列解析结果：

▲ 图5  Inclisiran-SS MSMS序列分析

▲ 图6  Inclisiran-AS Fragment Coverage Map

我们的优势

— 仪器资源丰富：配备小核酸专用生物液相UPLC，二维液相质谱2D-HPLC-MS，UPLC-MS，高分辨质谱Thermo Q Exactive和Biopharma Finder专业解析软件以及其他类ICP-MS，GC，NMR等专用分析仪器。能够满足小核酸药物的质量控制分析；

— 深厚的专业积累：具备小核酸从原料质量控制到小核酸产品合成工艺过程和放行成品的全套一系列分析专业技术经验，能够提供小核酸分析的质量控制手段，助力小核酸药物的开发；

— 高效、高质量和高性价比：可为客户提供从小核酸原料到成品的质量分析服务，以专业的QC、QA和技术团队为保障，高效服务，满足客户的不同类型的需求；

— 完善的质量管理体系：拥有经验丰富的小核酸分析人员，配备有先进的分析仪器设备以及完善的质量管理体系，确保数据和资料的真实性、完整性、可靠性和可溯源性，符合法规要求。可为客户提供小核酸开发全流程的快捷、高效、专业、灵活的分析服务，支持客户审计和配合官核查。

我们的服务

我们的仪器

Waters UPLC (ACQUITY Premier系统)

Waters UPLC-MS

Thermo scientific Q-Exactive & Vanquish （QE）

Thermo ICAP PQ 电感耦合等离子体质谱仪

参考文献：

[1] Zahar N M E , Magdy N , El-Kosasy A M ,et al.Chromatographic approaches for the characterization and quality control of therapeutic oligonucleotide impurities[J].Biomedical Chromatography, 2017.DOI:10.1002/bmc.4088.

[2] Bonilla J V , Srivatsa G S .Handbook of analysis of oligonucleotides and related products[M].CRC Press,2011.

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